Brigita Hengl¹, Snježana Zrnčić², Dražen Oraić², Andrea Gross Bošković¹, Relja Beck²

¹Hrvatska agencija za hranu, Osijek, Hrvatska
²Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, Hrvatska

Brojne skupine patogena koje se izlučuju fecesom i otporne su na “vodene” uvjete mogu uzrokovati infekcije širenjem vodom. U skupinu uzročnika koji se prenose vodom pripadaju bićaš Giardia duodenalis i vrste roda Cryptosporidium. Ove grgarine uključuju 27 vrsta i više od 60 genotipova, a dokazane su diljem svijeta kao vodeći uzrok gastrointestinalnih bolesti u brojnih kralježnjaka. Otkriveno je više od 15 vrsta iz roda Cryptosporidium koje uzrokuju infekcije ljudi, posebice imunosuprimiranih, a većina je povezana s vrstama Cryptosporidium hominis i Cryptosporidium parvum. Heterogeni protoozoon G. duodenalis podijeljen je na potencijalno zoonotske genske skupine A i B, te vrsno specifične skupine (C-H). Primarni način prijenosa predstavlja ingestija izuzetno otpornih oocisti u prijemljive životinje i ljudi, uključujući i morske organizme. Školjke se mogu koristiti kao indikatori onečišćenja patogenima, jer filtriraju mikroorganizme prisutne u moru tijekom hranjenja, te ih koncentriraju u probavnom sustavu, odnosno probavnoj žlijezdi. Budući da ne postoje podaci u RH o kriptosporidijama i gijardijama u školjkašima, pretražili smo kamenice (Ostrea edulis) i dagnje (Mytilus galloprovincialis) iz komercijalnih uzgoja s različitih mjesta na hrvatskoj obali.

DNA je ekstrahirana iz skupnih uzoraka probavnih žlijezda (3-5 školjkaša) s poznatim mjestom i datumom sakupljanja. Ukupno je pretraženo 693 uzorka (310 dagnji i 383 kamenica) “nested” PCR-om kojim se umnaža odsječak veličine oko 560 parova baza 18S rRNA gena svih pripadnika roda Cryptosporidium. TPI gen je korišten za istraživanje prisutnosti G. dudenlis u 1050 uzoraka (500 dagnji 550 kamenica). Uspješnost umnažanja potvrđena je kapilarnom elektroforezom, a pozitivni uzorci su zatim pročišćeni, sekvencionirani u oba smjera, te poravnani programom SeqMan Pro i uspoređeni s dostupnim sekvencama u GenBank pomoću BLAST tražilice.

U istraživanju je dokazana samo vrsta Cryptosporidium hominis u 3,1 % kamenica i 0,6 % dagnji sa ukupnom učestalošću od 2 % . Pozitivni uzorci su potjecali iz Savudrijske vale, Medulinskog zaljeva i Malostonskog zaljeva. Najučestalije su bile potencijalno zoonotske skupine G. duodenalis A I (1,4 % u dagnjama i 2,7 % u kamenicama), i skupina B (0,8 % u dagnjama i 0,4 % u kamenicama) dok su skupine specifične za pojedine nositelje C i E dokazane u 0,8 % i 0,2 % dagnji te u 0,4 % i 0,7 % kamenica. Kamenice su bile učestalije invadirane (4,2 %) od dagnji (3,2 %) a ukupnom učestalosti je iznosila 7 %.

Rezultati ovog istraživanja predstavljaju prvo molekularno dokazivanje kriptosporidija u Hrvatskoj i samim time i prvi nalaz u školjkaša. Dokaz humanog izolata C. hominis jasno ukazuje da ljudi predstavljaju izvor kontaminacije vode, a time i “infekcije” školjkaša. Daljnje studije o subgenotipizaciji Cryptosporidium hominis iz ljudi, vode i školjkaša, kao i drugih vrsta kao što je C. parvum u životinja i ljudi ključni su za razumijevanje njihove uloge kao izvora ljudskih infekcija u Hrvatskoj. Genske skupine G. duodenalis otkrivene ovim istraživanjem dokazane su u različitih životinja u Hrvatskoj no ovaj nalaz predstavlja prvi dokaz vrsno specifičnih i potencijalno zoonotskih genskih skupina u školjka iz gotovo svih istraženih lokacija. Dobiveni rezultati jasno ukazuju na različite izvore infekcije uključujući ljude, kanide i papkare. Temeljem dobivenih rezultata i dokazanih zoonotskih skupina A I G. duodenalis te C. hominis, može se zaključiti da postoji potencijalni rizik za ljudsko zdravlje.